发现 DTM miR-146a 和 miR-31 的表达降低后，我们接下来检查了肌营养不良蛋白的蛋白水平。免疫荧光染色显示，两种药物都会引起腓肠肌中肌营养不良蛋白的增加（图 6 A）。使用韦斯毛细管电泳对肌营养不良蛋白进行定量，我们发现两种药物均显着增加肌营养不良蛋白。接受瓦莫龙治疗后，腓肠肌肌营养不良蛋白增加了 49%（p < 0.0001），心脏肌营养不良蛋白增加了 55%（p = 0.0173）（图6B 和 6C）。泼尼松龙治疗后，腓肠肌肌营养不良蛋白增加了 37%（p < 0.0001），心脏肌营养不良蛋白增加了 26%（p = 0.2163）。我们观察到肌营养不良蛋白水平与三种 DTM 表达之间存在显着的负相关 (p < 0.01)，这支持了 DTM 和肌营养不良蛋白水平之间的负相关关系 (miR-31: r = -0.6169; miR-146a: r = -0.6160 ；miR-223：r = -0.6656），其在腓肠肌内对药物治疗的反应有所下降（图6D）。同样与 DTM 和肌营养不良蛋白之间的联系一致，在不同的肌肉中，我们观察到药物治疗对 DTM 的影响减少，我们也发现对肌营养不良蛋白水平没有显着影响（TA，图 S5 ）A-S5C）。总之，这些数据与 DTM 对疾病期间肌营养不良蛋白水平的调节一致，并支持肌营养不良蛋白蛋白的治疗诱导作为 BMD 中瓦莫龙的新治疗机制以及作为 DMD 外显子跳跃联合疗法。

我们发现瓦莫龙和泼尼松龙都可以通过影响炎症 miRNA 通路来增加肌营养不良蛋白蛋白，从而改善 BMD 中的肌肉疾病。瓦莫洛龙是一种一流的解离类固醇，通过 GR 提供选择性抗炎功效，通过减少对类固醇反式激活途径的影响，与泼尼松相比，安全性更高。皮质类固醇对炎症 miRNA 的影响与肌营养不良蛋白水平呈负相关。此外，瓦莫龙通过进化上保守的 MR 受体作为拮抗剂发挥作用，保护心脏免受营养不良性心肌病的侵害。该特性类似于特定的拮抗剂依普利酮，并且与 MR 受体激动剂泼尼松龙直接相反。一起，

到目前为止，BMD 疗法的发展一直因缺乏动物模型而受到阻碍。虽然一些患者使用血管紧张素转换酶抑制剂对心肌病进行对症治疗，但目前尚无批准的 BMD 治疗方法。目前正在 BMD 和肢带型肌营养不良症 (LGMD) 患者的组合中测试每周泼尼松治疗 (NCT04054375)。另外两种药物目前正在进行以 BMD 为重点的临床试验。第一个是 EDG-5506，一种快速骨骼肌肌球蛋白抑制剂 (NCT05160415)。另一种是每日瓦莫洛龙，我们在此提供第一个体内BMD 小鼠模型的证据 (NCT05166109)。与 BMD 的干预试验数量较少相比，目前正在进行大约 30 项 DMD 的干预试验。展望未来，开发 BMD 疗法将变得越来越重要，因为许多 DMD 疗法的目标是通过外显子跳跃或基因疗法。

我们的临床前数据也支持泼尼松治疗 BMD 的功效，可以立即开具处方。我们发现泼尼松龙可以改善 BMD 模型小鼠的肌肉力量和病理学，减少肌营养不良蛋白靶向 miRNA，并增加肌营养不良蛋白水平。为了帮助控制泼尼松的副作用，我们将小鼠的治疗推迟到 6 周开始，而不是我们之前在更严重的DMD mdx模型中的研究中的 2 周起始点。与mdx小鼠 (6.3%) 相比，泼尼松对bmx小鼠 (2.6%) 的生长抑制百分比较小。

目前，许多患有 DMD 的男孩从四到七岁左右开始服用慢性糖皮质激素，这会导致发育迟缓，包括生长迟缓、骨骼成熟延迟和青春期延迟。

与 DMD 患者相比，BMD 患者可以通过将治疗开始延迟到较晚的年龄（可能是青少年或青春期后）来减少或避免这些副作用。然而，慢性糖皮质激素的一些负面影响并不影响发育，仍然会影响生活质量。帮助减少这些影响的另一种策略可能是应用间歇或周末给药方案，例如正在进行的 BMD 和 LGMD 患者每周泼尼松给药试验 (NCT04054375)。然而，最近一项 DMD 试验的数据支持每日使用皮质类固醇疗法，而不是间歇性疗法，因此需要对此类替代疗法进行进一步研究。

我们实验室之前的研究表明，DTM 与转录本的肌营养不良蛋白 3′ UTR 结合，并下调带有人肌营养不良蛋白 3′ UTR 的报告构建体（荧光素酶）的蛋白质表达。

我们发现：1) 炎症性 NF-κB 信号传导可增加 DTM 的表达，2) 这些 DTM 在 BMD、DMD 和肌炎等肌肉疾病中上调，3) 伐莫龙可降低 mdx 小鼠中 DTM 的表达。

鉴于mdx小鼠不产生肌营养不良蛋白，我们在之前的研究中无法检测肌营养不良蛋白的水平。在这里，我们发现瓦莫龙显着降低了骨骼肌和心脏中的 DTM，并显着增加了肌营养不良蛋白。与此一致的是，之前的研究表明，与仅用外显子跳跃寡核苷酸治疗的mdx小鼠相比，用外显子跳跃寡核苷酸和泼尼松龙治疗的mdx中肌营养不良蛋白水平增加。

在 BMD 患者肌肉培养物中，甲基强的松龙治疗增加了肌营养不良蛋白的表达。

有趣的是，用泼尼松龙处理的野生型 iPSC 衍生的肌纤维增加了肌营养不良蛋白，这表明即使抑制 DTM 的基础水平也可能足以增加肌营养不良蛋白。

我们发现，瓦莫龙治疗后显着增加腓肠肌和心脏中的肌营养不良蛋白，但不增加 TA。我们还表明，通过瓦莫龙治疗，腓肠肌和心脏中的 DTM miR-146a 和 miR-31 显着减少，但 TA 中则没有。总之，这些数据表明 miR-146a 和 miR-31 的减少可能是肌营养不良蛋白水平增加的原因。未来研究将检验bmx或mdx中 DTM 或 miRNA 抑制剂的敲除需要用外显子跳跃寡核苷酸治疗的小鼠才能将肌营养不良蛋白的蛋白质水平和 DTM 的表达直接联系起来。miR 和抗肌营养不良蛋白增加所观察到的肌肉受累差异可能与人类 MRI 研究中肌肉受累严重程度的差异有关，其中 TA 显示比腓肠肌进展缓慢。

在mdx小鼠中，我们在之前的研究中发现，肌营养不良蛋白的缺失会导致“二次打击”，使心脏容易受到 MR 驱动的心脏损伤，而 MR 激动剂对具有全长肌营养不良蛋白的野生型小鼠没有影响。
在这里，我们发现泼尼松龙和瓦莫龙都显着降低炎症和纤维化基因的表达。GR/MR 双重激动剂泼尼松龙也不会增加bmx小鼠的心脏纤维化或损伤。这表明抗肌萎缩蛋白Δex45-47可能为心脏提供一定程度的保护，使其免受MR介导的损伤和纤维化。然而，需要对老年小鼠、应激心脏、替代抗肌萎缩蛋白亚型或 MR 特异性配体进行进一步研究，以更全面地评估所提供的保护水平。

一个重要的问题是，泼尼松治疗 DMD 的功效是否来自免疫细胞类型的抗炎作用，还是直接来自患病肌纤维的抗炎作用。我们发现泼尼松龙和瓦莫龙显着降低骨骼肌中炎症基因和 miRNA 的水平。然而，骨骼肌的苏木精和伊红染色并未显示药物治疗小鼠的免疫细胞浸润有任何差异。这表明泼尼松龙和瓦莫龙直接作用于肌纤维，以减少肌纤维和肌核内的炎症基因表达。与此一致的是，泼尼松龙改善了具有 DMD 患者突变的 iPSC 衍生肌纤维的疾病表型。

虽然泼尼松龙和瓦莫龙改善了小轮车小鼠的疾病病理，但瓦莫龙避免或减少了泼尼松龙对生活质量产生负面影响的副作用。先前的临床前报告表明，与泼尼松龙相比，瓦莫龙龙的副作用减少，通过 microCT 分析，泼尼松龙会导致骨质流失、血糖和胰岛素水平导致葡萄糖失调、脾细胞流式细胞术导致免疫抑制以及生长迟缓。

在这里和之前对mdx小鼠的研究中，我们发现泼尼松龙治疗显着阻碍小鼠的生长，而瓦莫龙治疗对生长的影响要小得多。
现在的临床数据表明，这种副作用在人体中同样可以被瓦莫洛龙消除。最近，在一项针对 DMD 患者的瓦莫龙和泼尼松的随机、双盲、安慰剂对照、平行临床试验中，泼尼松导致患者身高百分位数显着下降。泼尼松组与两个瓦莫龙治疗组显着不同，两个治疗组的身高百分位数均未出现下降。其他研究小组表明，MR 激动剂（如泼尼松龙）会引起焦虑，而 MR 拮抗剂则不会引起焦虑。

在这里，我们还发现泼尼松龙会增加高架十字迷宫中小轮车小鼠的焦虑，而瓦莫龙则避免了这种副作用。未来的研究应该扩展我们为期十周的试验的结果，以模拟类固醇在 BMD 患者中的长期临床应用，以便分析它们对额外安全措施和后期结果（如心功能）的影响。目前，我们的研究结果与瓦莫龙与泼尼松临床试验中观察到的安全性差异基本一致。

慢性糖皮质激素可导致患者体重增加、肥胖和库欣样特征。然而，我们和其他人一致发现药理糖皮质激素会降低mdx小鼠的体重。

这些效应可能反映了物种之间的剂量依赖性差异。啮齿类动物较高治疗剂量的药理学糖皮质激素（包括泼尼松、地夫可特、地塞米松和曲安西龙）会导致体重下降，并导致瘦素增加。

相反，补充低剂量的生理性糖皮质激素会导致啮齿动物体重增加以及肥胖症。
啮齿类动物棕色脂肪含量或反应的差异有助于防止代谢功能障碍，可能会导致物种差异。

在啮齿动物研究中，剂量、棕色或褐变脂肪、室温、饮食、性别、基因型和肥胖状况等因素都被发现会影响糖皮质激素对体重、肌肉、新陈代谢或肥胖的影响。

展望未来，有必要针对肌肉营养不良症的病因和治疗中的肥胖和代谢进行研究。随着这一领域的不断涌现，这些可以让我们更深入地了解体重和肥胖对患者或动物模型营养不良表型的作用，以及消除类固醇代谢副作用的潜力。

我们的研究结果可能对其他以炎症继发的肌营养不良蛋白减少为特征的肌肉疾病（例如肌炎）有影响。

女性 DMD 携带者也显示肌营养不良蛋白减少，但其肌肉中正常/异常DMD基因的比例并不合理，这同样表明炎症介导的肌营养不良蛋白减少可能对瓦莫洛龙治疗有反应。
除了 BMD 患者外，瓦莫洛龙还具有明显提高接受外显子跳跃反义寡核苷酸药物（eteplirsen、golodirsen、viltolarsen 和 casimersen）治疗的 DMD 患者肌营养不良蛋白水平的潜力。由于肌营养不良蛋白 3′ UTR 在 BMD 和外显子跳跃 DMD 转录物之间是保守的，因此它们都应该受到 DTM 的调节和类固醇的上调。一项检查用 2′- O-甲基硫代磷酸酯反义寡核苷酸治疗的mdx小鼠肌营养不良蛋白水平的研究表明，与仅用反义寡核苷酸治疗的小鼠相比，泼尼松龙联合治疗的肌营养不良蛋白增加。

这表明，与瓦莫龙联合治疗可能会进一步增加mdx小鼠和接受外显子跳跃药物治疗的 DMD 患者的肌营养不良蛋白水平，而不会出现泼尼松龙的严重副作用。未来对用瓦莫洛龙和外显子跳跃寡核苷酸联合治疗的mdx小鼠进行研究是有必要的。

总之，我们证明，与传统皮质类固醇相比，瓦莫龙可增强bmx小鼠的运动功能、改善肌肉组织病理学并增加肌营养不良蛋白水平，且安全性更高。肌肉炎症和抗肌营养不良蛋白继发性下调的共同分子病理学在肌炎、LGMD 和心肌梗塞等其他肌肉疾病中也可见到。

我们的数据表明，瓦莫龙特别有利于 BMD 和 DMD 患者群体，以及影响肌肉或心脏的其他疾病。